PCR試劑盒特點(diǎn)和使用方法
點(diǎn)擊次數(shù):784次 更新時間:2020-06-17
PCR試劑盒特點(diǎn)和使用方法
熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,實時監(jiān)控反應(yīng)過程。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一次熒光強(qiáng)度信號,這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析,可以得到熒光擴(kuò)增曲線,計算待測樣品初始模版的量。實時熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍,運(yùn)用該項技術(shù),可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行相對定量、定量和定性分析。
PCR試劑盒產(chǎn)品及特點(diǎn):
1.即開即用,用戶只需要提供腸賈第蟲樣品。
2.根據(jù)腸賈第蟲保守序列設(shè)計的專一性引物,與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3.靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4.一管式熒光定量PCR檢測,避免后續(xù)污染。
5.PCR試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
PCR試劑盒使用方法:
一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)
1.注意:由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2.標(biāo)記6個離心管
3.用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。
4.在7號管中加入5μL1×10E8拷貝/μL的陽性對照,充分震蕩1分鐘,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5.換槍頭,在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭,在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8.如果有N個樣品,必須設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4拷貝/μL,10μL相當(dāng)于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5拷貝/μL,10μL相當(dāng)于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,則PC和NC的體積也必須是200μL。
9.用自選方法純化樣品的DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進(jìn)行)
10.如果只做1次重復(fù),則標(biāo)記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù),則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11.在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加。
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